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临床测序中基因变异分析的最佳实践
Best practices for variant calling in clinical sequencing，于2021年6月10日发表在Developmental Medicine and Child Neurology (IF=5.449) 上。
观点论述
二代测序（NGS）的快速发展加速了遗传病和癌症等领域的研究，并且作为一种先进的基因检测手段应用于临床。随着 NGS 技术的不断发展，也涌现了一些优秀的用于基因变异分析（variants calling）的软件工具。该文章不仅分析了不同测序策略的相对优势和劣势，还针对不同变异类型分享了其在的工具以及分析、验证和基准测试中的实践经验。
三种测序策略
不同测序策略的选择对variants calling 具有重要的影响，三种测序策略分别为单或多基因的panel、全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES），每种测序策略都各有利弊。所以测序策略的选择需基于多种因素考虑。
单或多基因的panel
panel测得基因数量少，测序深度最高可达500x，从而可以检测到基因的低频变异，成本低，时间快。
分析具体临床表型相关的基因变异，推荐panel，如OtoSCOPE 听力缺失panel，主要靶向与听力缺失相关的89个基因和microRNA。
Panel的劣势是无法检测基因的结构变异（SV）。
全基因组测序（WGS）
WGS 覆盖整个基因组，平均深度达到30-60x，可以很好的检测出所有类型的变异，并且三种策略中只有WGS才可以检测SV。
但是WGS的成本高，时间久。
全外显子组测序（WES）
WES则介于panel和WGS之间。
所以测序策略的选择是基于多种因素考虑。
两种变异类型
该文章分别对两种变异类型—胚系突变（Germline Mutation）和体细胞突变（Somatic Mutation）—给出了具体的分析工具和方法。
胚系突变
胚系突变实际是来自上一代的生殖细胞，这种突变会随着胚胎发育一直存在，而在研究方法上，家系分析在胚系突变的分析中占有重要地位。所以在测序过程中，除了先证者个体测序之外，还会加上个体的家属一同测序。
体细胞突变
体细胞突变是不遗传的（非生殖细胞），在研究方法上主要偏重采集癌症组织和正常组织进行比较得到结果。
在检测变异之前，需要做一些预处理。Variant calling 对测序数据的质量要求极高，首先对下机后的数据进行质控，接着将质控后的数据比对到参考基因组，文章中推荐的比对软件是BWA-MEM，比对完之后使用Picard 软件对bam文件进行duplicate 标记，以区分哪些是PCR重复的产物，以便后续分析过滤掉这部分重复数据。GATK 中的模块会对bam文件进行重比对，以纠正mapping时导致的错误（图2A）。
胚系突变分析主要是家系分析，需要指出的一点是，家系的样本在采样和测序的过程中需要完全相同条件，确保检测出的变异不是由于外界干扰导致的。家系分析的样本预处理可以单独进行，而在后续的variant calling时需要联合分析，这样才能判断变异是由遗传导致的还是新生突变。
NGS变异分析的主要步骤及
过程中常用的软件列表
SNV/indel的分析文章中推荐的软件为GATK HaplotypeCaller或Platypus。而CNV和SV分析所利用的软件各有优缺点，需要联合多款软件分析，从而达到灵敏度和特异性的平衡。虽然二代测序技术经过一代测序验证准确率高达99%以上，但因二代测序技术本身还是会产生背景噪音，所以噪音导致的SNVs/indels需要过滤掉。再经过人工使用可视化软件Integrative Genomics Viewer （IGV）对变异进行校验（图3），过滤假阳性。新生突变必须经过sanger测序进行正交验证，而遗传变异不一定需要正交验证，但是至少要满足10个标准，如测序深度， 质量分数, 变异等位基因的序列等（图2B）。
图3 使用IGV可视化软件人工校验变异
评估变异检测的准确性，需要真实变异的数据集来测试软件的准确性。目前最广泛使用的是Genome in a Bottle (GIAB) 和Platinum 数据库中的NA12878 的数据集，这是一个来自欧洲的人类样本，该样本已被世界各地实验室通过各种不同的技术方法进行了测序。
总结
利用NGS数据进行基因变异分析，和NGS技术一样经过十多年的发展，发生了很多变化，仍是一个非常热门的研究领域。NGS 变异分析流程包括比对和预处理、变异分析、过滤噪音及假阳性和人工审查等步骤。有些类型的变异分析只需要单个软件即可，而有些则需要多款软件联合分析。
Koboldt DC. Best practices for variant calling in clinical sequencing. Genome Med. 2020 Oct 26;12(1):91. doi: 10.1186/s13073-020-00791-w. PMID: 33106175; PMCID: PMC7586657.