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人类参考基因组GRCh37 VS GRCh38
目前，广泛使用的参考基因组版本是GRCh37和GRCh38。2009年，the Genome Reference Consortium (GRC)发布了第19版人类基因组GRCh37，也常被称为hg19。GRCh37被广泛应用于数据分析。2013年，GRC发布了GRCh38。但由于注释工具、数据库的不健全及升级基因组工作繁杂，时至今日，GRCh37仍被相当程度地使用。
根据GRC的官方文件，GRCh38是最精确的人类基因组。GRCh38基于金标准Sanger测序组装，读长约为1000bp，精确度是高通量测序的10倍。与GRCh37相比，GRCh38替换了8000个等位基因位点，校正了数个组装错误的基因组区域，补全了gap，添加了着丝粒序列，在178个区域组装了261条alternate loci，丰富了基因组的多样性。
已发表的论文认为GRCh38是GRCh37的重大升级，可提供更精确的生物信息学和基因组学分析。我们设计了实验量化基于GRCh38和GRCh37的数据分析差异。
实 验 结 果
表1 GRCh37、GRCh38基因组之间的比较
不算线粒体DNA，GRCh37 和GRCh38分别有3,095,677,412和3,088,269,832个核苷酸。最常用的线粒体基因组是1999年剑桥发布的rCRS，因此两者线粒体基因组是一样的。在基因组fasta文件中，‘N’表示gap或者未注释区域，GRCh37共有234,350,281个‘N’，而GRCh38中有150,630,719个，减少了83,719,562个，占比35.7%。从表1中可看出，每条染色体上的‘N’数量都有减少。
有文献研究表明GC含量影响Illumina测序深度及测序均一性，这与后续的CNV检测密切相关。GC位点的总数从GRCh37的1,170,371,008增加到GRCh38的1,200,551,672，共计增加了30,180,664个核苷酸。
外显子可以编码氨基酸，是人类基因组最重要的组成部分。从Ensembl (GRCh37 v37.75, GRCh38 v38.82)下载最新的Gene Feature Format (GTF)文件统计外显子区域。
外显子区域由GRCh37的75,231,228个核苷酸增加到GRCh38的95,505,476个，约有26.9%的增幅。从全基因组水平看，外显子占比由2.43%增至3.09%。外显子区域扩大的主要原因有3个：i.在GRCh38中，外显子的总数从327,058个增加到457,748个；ii.每个基因的外显子数从13个增加到19个；iii.每个外显子核苷酸的中位数从140增加到146。
表2 SNV类别
图1 GRCH37与GRCH38之间的映射率比较
我们分别用GRCh38和GRCh37分析了30个WES样本，然后从染色体统计、比对、SNV、InDel、CNV和SV等多个维度比较了分析结果差异。
比对是高通量测序数据分析中非常重要的一步。总有部分reads无法比对至参考基因组，有论文指出改进基因组可以提高比对率。从图1可看出，30个WES样本的比对率都得到了提高，提高均值为0.0017%。外显子区域的比对率明显提高，约为3.22%，主要原因是外显子区域扩大，相应地内含子的比对率降低了2.70%。
图2 GRCh37与GRCh38的SNV、InDel比对结果
使用GRCh37时，检测到4,656,461个SNV，GRCh38时只有4,617,859个。这表明，改进后的GRCh38产生更少的假阳性SNVs。非同义变异是我们关注的重点，虽SNV总数变少，但GRCh38比GRCh37多了22,622个非同义变异，主要原因是外显子区域增加。使用LiftOver 转化参考基因基因组坐标后显示，两种基因组中93%SNV和88%InDel是一致的，且质量值和覆盖度并无差异。
GRCh37检测到3,702个CNV，GRCh38检测到3,732个CNV。其中，88.4%CNV是一致的。两种基因组都检测到了更多的重复片段。使用GRCh37，我们检测到了371,558个结构变异，GRCh38检测到了271,825个结构变异。83%的结构变异同时在两个基因组中检测到。结构变异检测难度大，就有较高的假阳性率。分析结果显示，与GRCh37相比，GRCh38中结构变异数少得多（少26.8%）。虽然我们没有金标准来计算真阳性率和真阴性率，但变异数量减少预示着假阳性率降低。
实 验 结 论
重组人类基因组是一项费时又费力的任务，截止2018，人类基因组已经发布了20个版本。GRCh38中一个重要的技术进步是葡萄胎的应用。葡萄胎没有从卵子获得染色体，精子的染色体发生了复制，因此没有等位基因变异，可用于获得基因组上高度同源区域的reads。GRCh38并不是完美的人类基因组，其主要缺陷在着丝粒的区域。该区域包括数百万个碱基，序列高度重复。GRCh37着丝粒区域以gap形式存在，GRCh38建立模型推测的，虽不准确，但还是向前迈进了一大步。
人类基因组仅代表在基因组位点上的1个等位基因位点。参考等位基因是根据一个小群体的基因组确定的，可能并不是主要等位基因（人群频率>50%）。在某些情况下，检测的目标人种没有参考等位基因存在。目前的检测软件，如GATK，Platypus都允许一个位置存在多种等位基因。
基于GRCh37和GRCh38的WES样本数据分析显示，我们明确了GRCh38可以得到更准确的分析结果。GRCh38具有更好的比对效果，对后续CNV及结构变异的检测都具有正面影响。
综上所述，GRCh38是人类基因组从GRCh37迈出的一大步，基因组准确度的提升对于高通量测序数据分析具有明显的积极意义。
参考文献：
Guo Y, Dai Y, Yu H, et al. Improvements and impacts of GRCh38 human reference on high throughput sequencing data analysis[J]. Genomics, 2017, 109(2): 83-90.